È nato un vitello Crispr. È sicuramente un ragazzo

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Il polpaccio era in ritardo. La sua data di scadenza, marzo 25, era venuto e se ne era andato. All'inizio, Alison Van Eenennaam lo ha assegnato a vitelli maschi che tendevano ad arrivare un giorno o due sul lato ritardato. Mentre la settimana andava avanti, il genetista animale si ricordò che gli embrioni modificati dal gene – come quello che era cresciuto dentro Cow 3113 negli ultimi nove mesi — può richiedere un po ' più tempo per segnalare alle loro madri surrogate che sono pronti a nascere. Ma entro la settimana seguente, due falsi allarmi presso l'UC Davis Beef Barn più tardi, senza ancora segni di imminente lavoro, i nervi sfilacciati di Van Eenennaam ne avevano avuto abbastanza. Ha chiamato il veterinario. Era tempo di indurre.

Dopo quasi cinque anni di ricerche, almeno mezzo milione di dollari, dozzine di gravidanze fallite e innumerevoli battute d'arresto scientifiche, Van Eenennaam Il tentativo pionieristico di creare una linea di bovini Crispr'd su misura per le esigenze dell'industria della carne bovina è arrivato a questo vitello. Chi, per fortuna, sembrava sicuro di averlo, stava per entrare nel mondo nel mezzo di una pandemia globale .

Solo poche settimane prima, il governatore della California aveva ordinato l'intero stato di rimanere a casa per evitare la diffusione un nuovo coronavirus mortale . Ciò stava seguendo la scoperta del primo caso di diffusione della comunità negli Stati Uniti. Il paziente è stato curato presso l'UC Davis Medical Center circa 20 miglia di distanza dal fienile. I letti ICU nella Bay Area stavano riempiendo . Van Eenennaam era preoccupato per quello che sarebbe potuto accadere se la consegna fosse andata a sud e dovevano fare un taglio cesareo; ai veterinari veniva chiesto di salvare i loro sedativi per aiutare a soddisfare la crescente domanda di Covid (umano) – 19 pazienti con ventilatori. E come se ciò non fosse abbastanza inquietante, il residente veterinario arrivato quel giorno per sovrintendere alla nascita aveva trascorso la mattinata a deporre un numero di pecore del branco di UC Davis che erano state mutilate dai coyote nella notte.

“Dato come è andato questo progetto, questo sul serio non avrebbe potuto concludersi in modo molto diverso”, ha detto Van Eenennaam, la sua inclinazione australiana si tinge di inquieto sarcasmo. “È come se i tre cavalieri dell'apocalisse probabilmente si trovassero sulla sua coda.”

Non è esattamente quello che è successo. Il vitello arrivò quel pomeriggio, 75 libbre e jet black, salvo un tocco di bianco alla caviglia al di sopra dei suoi zoccoli posteriori. Due veterinari hanno dovuto estrarlo da Cow 2017 con catene, ma quando fu calato sul cortile coperto di paglia, era vivo e respirava. “Cosmoooooooooo”, urlava Van Eenennaam in trionfo. “Benvenuto nel mondo, piccolo ragazzo!”

Il cielo non si oscurò e il mondo non finì. Ma il vitello nero, sebbene grande, forte e sano, non era esattamente quello che gli scienziati avevano sperato di creare. Uno sguardo ravvicinato al suo DNA rivelerebbe quanto possa essere imprevedibile l'editing genico di Crispr e quanto ancora più scienziati debbano ancora imparare prima che la tecnologia possa diventare pratica di routine per la riproduzione animale.

Joey Owen non è mai stato un vero animaletto. Aveva studiato biochimica e poi genetica del cancro prima di farsi strada nel laboratorio zootecnico di Van Eenennaam in 2014. È stato un periodo di speranza per scienziati come loro. Il potenziale di ingegneria genomica di Crispr era stato scoperto solo due anni prima. Ha aperto la possibilità di creare addomesticati di design senza la necessità di trasferire i geni da una specie all'altra. Le più vecchie tecnologie di ingegneria genetica si basavano sull'uso di virus e batteri per spargere il DNA, innescando un lungo e costoso processo di approvazione da parte dei regolatori statunitensi. Di conseguenza, gli agricoltori e gli allevatori americani hanno fatto affidamento finora solo sui progressi pungenti dell'allevamento selettivo per migliorare i geni delle loro mandrie e greggi. Crispr ha promesso di cambiarlo .

Van Eenennaam aveva gli occhi fissi sul bestiame e un gene chiamato SRY, un lungo tratto sul cromosoma Y che istruisce embrioni di mammiferi per sviluppare tratti maschili. In natura, c'è un'eguale probabilità che le mucche (e le persone, del resto) partoriscano una prole maschio (XY) o femmina (XX). Ma se potesse usare Crispr per aggiungere una copia di SRY sul cromosoma X degli embrioni bovini, allora potrebbe distorcere le probabilità a favore della produzione di una mandria di soli maschi. Qualsiasi animale con il gene SRY sarebbe fisiologicamente maschio, anche quelli geneticamente XX. Questa era l'ipotesi che voleva testare, comunque. Nessuno l'aveva mai fatto prima.

Nell'industria delle carni bovine, a cui piacciono i suoi bovini più grandi e magri, più maschi significano più soldi, più meglio. Poiché i vitelli maschi aumentano di peso in modo più efficiente rispetto alle femmine, gli agricoltori potrebbero produrre le stesse quantità di carne con meno animali, riducendo potenzialmente le emissioni di riscaldamento del pianeta del settore . Se Van Eenennaam potesse dimostrare il concetto, ciò potrebbe aprire la strada alla creazione di altre specie single-sex – stormi di femmine di galline ovaiole e mandrie di mucche da latte – e alla fine, si sentiva, un sistema di produzione industriale alimentare meno crudele.

Ma l'esperimento che lei e Owen hanno condotto al Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti è stato incredibilmente ambizioso. Richiederebbe l'inserimento di un grosso pezzo di DNA negli embrioni bovini. Quando hanno richiesto una sovvenzione per la valutazione del rischio biotecnologico da parte dell'USDA, modifiche simili utilizzando Crispr erano state fatte solo due volte prima nelle cellule di mucca e mai negli embrioni. Tuttavia, l'agenzia ha assegnato loro una sovvenzione quinquennale del valore di $ 500, 000. “Quando l'USDA ha finanziato il nostro progetto eravamo come” Aspetta, davvero? “”, Ha ricordato Owen. E fin dall'inizio, quasi nulla è andato secondo i piani.

Il primo passo è stato cercare di convincere Crispr a fare le modifiche che volevano negli embrioni bovini. Crispr è essenzialmente un bisturi molecolare programmabile. Funziona mirando una particolare posizione nel genoma e tagliando attraverso la spina dorsale a doppia elica del DNA. Quindi tocca al macchinario di riparazione della cellula ricucire insieme il DNA rotto. Se vuoi aggiungere nuovi frammenti di codice genetico tra quelle estremità libere, il trucco sta facendo scivolare il “DNA modello” cellulare – in questo caso una copia del gene SRY – insieme ai componenti di Crispr.

Questo approccio funziona meglio nelle celle che si stanno dividendo attivamente. Non tanto per gli embrioni a cellula singola, come presto scoprì Owen. “Stavamo gettando tutto contro il muro per vedere cosa fosse bloccato”, dice. “Nulla ha fatto.”

Quindi hanno ricominciato con un metodo più vecchio e meno preferito: modificare le cellule bovine e poi clonare il loro DNA nelle uova. (Più o meno nello stesso periodo, un gruppo di ricerca in Cina stava usando con successo questa tecnica per Crispr nel bestiame un gene per resistenza alla tubercolosi.) Per facilitare il processo, Owen ha aggiunto un gene per la proteina fluorescente verde, o GFP, insieme al gene SRY. Ciò gli avrebbe consentito di visualizzare quali cellule avevano inserito con successo la ricetta genetica per la virilità sul cromosoma X. Poi notò qualcosa di strano. Le cellule che incorporavano il nuovo DNA, quelle che brillavano, smettevano tutte di dividersi. La modifica aveva arrestato il loro sviluppo.

Quando avevano iniziato l'esperimento, i ricercatori avevano preso di mira una sezione del cromosoma X che sembrava essere all'interno di un tratto di DNA spazzatura, lontano da qualsiasi gene critico per la vita. Ma l'unica mappa del genoma bovino che era a loro disposizione in quel momento era un ritratto rozzo generato più di un decennio prima. Un genoma bovino aggiornato rilasciato nella primavera del 2015 ha rivelato che invece di inserire il gene SRY 10, 000 coppie di basi distanti da un gene essenziale per la crescita cellulare, come previsto, la squadra di Owen lo aveva bloccato proprio nel mezzo.

Tornarono indietro e riprogettarono il loro Sistema Crispr, usando la mappa aggiornata per evitare le modifiche da eventuali geni essenziali. Poi hanno provato di nuovo con gli embrioni. Questa volta ha funzionato. Ma ormai era l'estate di 2015; erano passati quasi tre anni. Il progetto era in ritardo. Hanno dovuto chiedere all'USDA una proroga della loro sovvenzione. La lunga serie di battute d'arresto ha fatto sentire Owen piuttosto scoraggiato, desiderando di non aver mai provato la sua mano al bestiame Crispring. Il suo recente successo con l'editing degli embrioni in una nuova posizione del cromosoma X lo aveva rinvigorito, ma quella sensazione ebbe vita breve. Il primo gruppo di embrioni modificati che hanno trasferito negli uteri di aspiranti giovenche surrogate non ha preso. Del lotto successivo, cinque embrioni sono stati impiantati e sono arrivati ​​alle prime fasi della gravidanza, solo da perdere poche settimane dopo.

Owen e Van Eenennaam si sono consultati con allevatori e veterinari su ciò che stavano facendo di sbagliato. Sospettavano che i ricercatori avessero danneggiato gli embrioni in laboratorio, forse durante la biopsia, quando avevano prelevato una piccola parte dell'embrione per sequenziarlo e determinare se la modifica aveva preso piede. Ciò richiede tempo e richiede il congelamento degli embrioni fino a quando i risultati non tornano dal laboratorio di sequenziamento. Ogni passaggio – il congelamento, la biopsia, l'editing – riduce la vitalità degli embrioni.

C'era un modo più semplice per farlo. Potrebbero ricollegare quel gene che produce fluorescenza e far brillare un lampo di luce UV sugli embrioni. Un bagliore verde direbbe che la modifica aveva funzionato, nessuna biopsia o congelamento richiesti. Ma ciò renderebbe transgenici quegli animali; Il GFP proviene da una specie di medusa bioluminescente che vive nelle acque al largo dello stato di Washington. E ciò li renderebbe organismi geneticamente modificati, o OGM, soggetti all'arduo processo di approvazione della FDA. Il punto centrale del progetto e l'utilizzo di Crispr era stato quello di evitarlo.

Tuttavia, il panorama normativo era cambiato mentre stavano armeggiando. A gennaio, 2017, la FDA ha deciso di classificare qualsiasi DNA animale modificato come se fosse un nuovo tipo di farmaco. Ciò significava che qualsiasi branco Crispr interamente maschio sarebbe soggetto allo stesso regolamento degli OGM di prima generazione. E se, agli occhi dei federali, spostare il DNA di mucca in giro fosse lo stesso dell'aggiunta di un gene di meduse, il team ha pensato, perché non rendere le loro vite un po 'più facili? Con poca speranza che qualsiasi allevatore di bestiame o entità commerciale sarebbe abbastanza interessato ai loro knock-in SRY da preoccuparsi di aggrovigliarsi con i federali, i ricercatori potrebbero anche andare avanti con il gene luminoso.

Van Eenennaam e Owen hanno provato un'ultima volta, spostando il gene SRY, insieme al gene incandescente, in circa 200 embrioni. Dato che era il loro colpo finale, decisero di apportare la modifica non sul cromosoma X, come avevano cercato di fare, ma in un sito portuale sicuro sul cromosoma 17. Ventidue embrioni sopravvissero a questo processo e, di questi, nove brillarono alla luce UV. Ma solo uno di loro era verde brillante dappertutto, dice Owen. E un mese dopo che tutti gli embrioni erano stati trasferiti in giovenche, quella verde brillante era l'unica gravidanza bloccata. Il team di ricerca ha deciso di nominare il vitello in crescita Cosmo, dopo un brillante carattere verde nella serie televisiva animata di Nickelodeon The Fairly OddParents, trasmessa a metà – 2000S. “Sono ovviamente troppo Boomer, perché non ne avevo mai sentito parlare”, afferma Van Eenennaam.

L'ecografia ha suggerito che Cosmo era un maschio. E quando è nato il 7 aprile, quella è stata la seconda cosa che il veterinario ha controllato, dopo essersi accertato che il polpaccio stesse respirando. “Sì, ha i testicoli – due di loro!” disse a Van Eenennaam e Owen. “Maschio fenotipico, è un buon inizio!”

Ma per sapere se aveva quelle parti maschili a causa di Crispr sarebbe necessario scrutare il DNA di Cosmo. La squadra estrasse alcune fiale di sangue dal collo del polpaccio e Owen lo corse verso il laboratorio e lo portò in frigorifero per iniziare un 16 – il tuo tempo di recupero. Andò a casa, bevve alcune birre per calmare la sua ansia impaziente e mise la sveglia per 6: 30 la prossima mattina. Alle 5: 00 Sono, si svegliò e si affrettò a tornare in laboratorio mentre era ancora buio. Owen ha estratto il DNA dal sangue del polpaccio e ha usato una tecnica chiamata elettroforesi su gel PCR per cercare la presenza dei geni SRY e GFP extra. Circa quattro ore dopo, quando la band si presentò proprio dove previsto, uno shock di euforia gli attraversò il corpo. “Merda, l'hai fatto davvero!” pensò tra sé.

Owen si guardò attorno, cogliendo l'attimo tra gli strumenti silenziosi. A causa della pandemia, solo una persona alla volta era autorizzata in laboratorio; i suoi colleghi si stavano tutti rifugiando a casa. Quindi scattò una foto del gel e mandò un'e-mail alla squadra.

Nel suo ufficio-camera da letto, Van Eenennaam fece clic sull'e-mail, pronto per essere più cattivo notizia. Invece, il trionfo la investì. “Yessss!” ricorda l'esclamazione, i pugni che pompano l'aria.

Il risultato del gel non è stato un totale fuoricampo. Rivelò che Cosmo era XY, nel senso che aveva ereditato una copia di SRY dal suo bull-dad biologico, così come il gene SRY che Owen aveva Crispr sul suo 17 cromosoma. Anche senza il montaggio, sarebbe sempre stato un maschio. Ma il knock-in aveva funzionato, usando Crispr in un embrione bovino per la prima volta in assoluto. “Ottenere quel risultato è stato davvero fantastico”, afferma Van Eenennaam. “In realtà è stato uno dei migliori giorni scientifici di sempre.”

Ma c'era qualcos'altro che era apparso nel primo, scansione rapida del DNA di Cosmo. Era un pezzo di codice genetico che non apparteneva a una mucca o una medusa, ma a un batterio. Per inserire un gene così grande – SRY è lungo qualche migliaio di lettere di DNA – nell'embrione monocellulare che sarebbe diventato Cosmo, Owen aveva dovuto consegnarlo nella cellula nell'unico modo in cui gli scienziati sapevano come: all'interno di un pezzo circolare di DNA batterico chiamato plasmide. Dopo che Crispr aveva effettuato i suoi tagli, gli enzimi di riparazione di Cosmo avevano afferrato il plasmide insieme al gene SRY e incollato tutto nel suo genoma.

Questo tipo di errore si è verificato prima. Un plasmide simile è stato scoperto l'anno scorso in una coppia di tori geneticamente dehorn creati dalla biotecnologia basata sul Minnesota società Recombinetics usando l'approccio clone-an-edit-cell-into-an-egg. Van Eenennaam ha ottenuto finanziamenti dall'USDA per studiare i tori di Recombinetics e i loro discendenti per vedere se l'alterazione genetica è stata ereditata come previsto. Il plasmide è stato scoperto da uno scienziato della FDA che analizzava i dati sulla sequenza del DNA da alcuni dei suoi discendenti, dopo che Van E aveva presentato una richiesta all'esenzione regolamentare affinché gli animali, prodotti presso la UC Davis, potessero essere macellati e venduti localmente.

Gli scienziati di Recombinetics non si sono mai preoccupati di cercare la presenza di plasmidi. Sebbene non sia stato dimostrato che tale DNA batterico produca effetti negativi sugli animali o sulla loro carne, in molti paesi li ridefinisce come OGM, sottoponendoli a un controllo regolamentare più rigoroso. La rivelazione ha affondato il piano dell'azienda per sollevare una mandria di fondatori in Brasile da uno dei semi di tori . È stato un duro colpo per la piccola ma in crescita industria del bestiame.

Ma è riuscito a sensibilizzare su tali potenziali problemi. Quindi il team di Van Eenennaam aveva programmato in anticipo di fare un tuffo nel DNA di Cosmo. Anche questo è stato complicato dalla pandemia. Il core di sequenziamento di UC Davis è stato chiuso. Quindi il team ha inviato frammenti di sangue, tessuti e placenta di Cosmo a due diverse aziende per mettere insieme ciò di cui era veramente fatto. Ciò che hanno ottenuto è stato ancora più strano di quanto si aspettassero.

Crispr aveva fatto i tagli che doveva. Ma poi ha fatto un po 'di più. Quindi nel luogo in cui Van Eenenaam e Owen avevano intenzione di incollare una singola copia di SRY e GFP, è diventato molto più complicato. Su un braccio del cromosoma 16, il nuovo DNA non ha preso affatto. La cellula prese casualmente 20 Lettere del DNA per colmare il vuoto. (È abbastanza normale per come le cellule riparano le rotture del DNA a doppio filamento). È stato l'altro braccio in cui è avvenuta la vera azione. Circa 70 percento di celle, sette copie di SRY e GFP erano state inserite. Due di esse erano state inserite all'indietro. E c'era anche il plasmide batterico. Circa 01 percento di cellule, c'erano tre copie (correttamente orientate) del costrutto SRY-GFP e un plasmide.

In ogni modo lo si collega, è molto SRY. Inoltre, c'era anche la copia sul cromosoma Y di Cosmo, quella che aveva ereditato da suo padre. “È un uomo molto virile”, afferma Van Eenennaam. Queste ripetizioni non erano la loro intenzione, dice, ma finora non sembrano dannose per Cosmo. “Il fatto che esista mi dice che avere più copie di SRY di quelle che ti servono non ti uccide”, dice.

Gli studi sui topi con copie extra di SRY non hanno ha rivelato qualsiasi prova che le mutazioni danneggino gli animali, sebbene possa causare sterilità in XX individui. Tuttavia, il cumulo di SRY di Cosmo è esattamente il tipo di conseguenze impreviste di cui i critici di Crispr si preoccupano quando si tratta dei rischi dell'editing genetico. Altri esperimenti all'estero, volti a portare sul mercato animali da fattoria di design, hanno prodotto strani effetti collaterali negli ultimi anni, tra cui lingue allargate di conigli, maiali con vertebre extra e morti premature di bovini. Lisa Moses, una bioetica degli animali presso la Harvard Medical School, disse al Wall Street Journal al tempo di tali rapporti affermano che “È davvero arrogante da parte nostra supporre che sappiamo cosa stiamo facendo e che possiamo prevedere quali tipi di cose brutte possono accadere.”

Fyodor Urnov, a L'esperto di editing genetico presso l'Innovative Genomics Institute della UC Berkeley, che non era coinvolto nel lavoro della UC Davis, afferma che non è realistico aspettarsi che esperimenti pionieristici come quello di Van Eenennaam finiscano perfettamente. “Hanno cercato di creare un toro attraverso l'integrazione mirata utilizzando l'editing genetico in un embrione, e in effetti ci sono riusciti”, afferma. È stata una modifica incontaminata? No. Questo significa che il campo è condannato? Assolutamente no, dice. “Esistono modi per superare questi problemi, ma non puoi risolverli finché non sai che sono lì.”

Ci vorranno anni di studio approfondito per vedere esattamente quale effetto di tutto ciò che SRY è davvero. Ma il team di UC Davis ha reso pubbliche le loro analisi iniziali del genoma di Cosmo giovedì mattina, durante una presentazione poster dell'American Society of Animal Science. Gaétan Burgio, genetista presso la Australian National University di Canberra, che ha esaminato i risultati, afferma di non essere sorpreso dal risultato tutt'altro che perfetto. Il suo gruppo usa abitualmente Crispr per aggiungere nuovi geni al DNA del topo per creare nuovi modelli per lo studio delle malattie umane. Copie multiple e inserimenti di plasmidi indesiderati sono molto tipici, dice. “Abbiamo visto molto di questo nei topi”, dice. A volte le cellule incorporeranno più copie del DNA batterico. Burgio ha visto fino a 30 in un animale. “È un vero incubo fare knock-in usando Crispr”, dice.

Il caos dipende tutto dalla cinetica degli enzimi che modificano il gene, dice. Ogni volta che si rompe il DNA in modo pulito in due, è difficile controllare il risultato. Ma gli scienziati non lo sapevano davvero nei primi anni della ricerca sulla modifica genetica di Crispr, quando Van Eenennaam iniziò il suo progetto per bovini per soli uomini. I rapporti di inserimenti errati e altre alterazioni indesiderate non hanno iniziato a comparire nei topi fino a tardi 2017, dice Burgio.

Alcuni nuovi costrutti Crispr evitano tali errori solo intaccando il DNA, limitando le opportunità di inserimenti indesiderati. Ma questi sistemi sono spesso instabili in altri modi: potrebbero funzionare solo in una piccola frazione di celle o apportare altri tipi di modifiche off-script. “La linea di fondo è: non esiste uno strumento perfetto”, afferma Burgio. Il design e l'analisi dell'esperimento sul bestiame del team UC Davis gli sembrano validi. Eppure è un'ulteriore prova che l'utilizzo di Crispr per ridisegnare il DNA del bestiame è ancora una scienza molto nuova. “In questo momento siamo bravi a rendere efficace l'editing genetico negli animali, ma non siamo ancora bravi a renderlo sicuro. Penso che ci arriveremo. Ma abbiamo ancora un bel po 'di lavoro da fare “, afferma.

Per Van Eenennaam, quel lavoro includerà elevare Cosmo alla maturità riproduttiva, raccogliendo il suo seme la prossima primavera, e cercando di produrre una nuova generazione di vitelli. In teoria, dovrebbe produrre 50 percentuale di progenie maschile: il normale 50 percento che erediterebbe il suo cromosoma Y e un ulteriore 25 percento che riceverebbe i geni SRY Crispr'd nel suo 17 th cromosoma. Van Eenennaam spera di studiare se quelle copie sono sufficienti per capovolgere la programmazione dello sviluppo per far apparire e agire (e ingrassare) le femmine di animali cromosomicamente femminili come i maschi. Dovrà richiedere una nuova sovvenzione per realizzare questi prossimi esperimenti.

Sarà tutta una pura ricerca; I geni delle meduse di Cosmo se ne sono assicurati, anche prima che il plasmide si presentasse. Né lui né la sua discendenza entreranno mai nella fornitura di cibo. È probabile che la loro storia finisca in un inceneritore della UC Davis.

Se la fase successiva non funziona, potrebbe essere la fine della ricerca di Van Eenennaam di un branco di bovini tutto maschio . “Dato quanto sia difficile ottenere un knock-in, non sono sicuro che avrei alzato di nuovo la mano per questo progetto”, dice.

Ma non è così significa che i suoi sforzi non aiuteranno a spingere il campo in avanti. In Australia, i ricercatori stanno usando Crispr per identificare il sesso di un pollo il giorno in cui viene deposto l'uovo, in modo che le uova con embrioni maschili possano essere distrutte prima che si trasformino in pulcini che sentono e masticano. In Germania, i ricercatori stanno usando Crispr per modificare lo sperma di maiale in modo che tutta la loro prole sia femmina, perché i maschi crescono per produrre un cocktail chimico che rovina l'appetito chiamato “taar taint” nella loro carne. Oggi, gli agricoltori spesso cercano di evitarlo castrando suinetti maschi senza anestetici, una pratica brutale che il governo tedesco ha recentemente vietato. (La legge entrerà in vigore il prossimo anno). E decine di altri progetti che mirano a utilizzare Crispr per rendere gli animali meno sensibili alle malattie e altre crudeltà dell'agricoltura industriale sono in corso anche in altre parti del mondo. Cosmo avrà molto da insegnare a tutti loro.


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